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本产品是一种提供了配制用于RNA电泳的尿素聚丙烯酰胺凝胶(Urea-PAGE凝胶)所需的各种试剂的试剂盒。仅需自备制胶器具，即可完成Urea- PAGE胶的配制。

本试剂盒不仅可用于配制Urea-PAGE凝胶，也可用于配制非变性PAGE胶，即native PAGE。本试剂盒中的所有组分均经DEPC处理，可用于RNA的电泳分析检测。

• 当检测对象为单链RNA时，使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶(Denatured Urea-PAGE)；当检测对象为双链RNA时，使用非变性聚丙烯酰胺凝胶(Native PAGE)。
  
• 凝胶聚合催化剂用DEPC水配制成10%溶液后，应当-20℃保存。同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
  
• TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
  
• TEMED易燃，有腐蚀性，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或腐蚀其它物品。
  
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 10%凝胶聚合催化剂的配制：例如称取0.1g凝胶聚合催化剂，用DEPC水溶解，并定容至1mL，即为10%凝胶聚合催化剂。
  
• 根据目的RNA的大小选择合适的凝胶浓度，再按照后附的表格配制Urea-PAGE凝胶。
  不同浓度的Urea-PAGE凝胶的最佳分离范围：
  

  Urea-PAGE (%)	RNA size (nt)
  20-30	2-8
  15-20	8-25
  13-15	15-35
  10-13	35-45
  8-10	45-70
  6-8	70-300

  
  

  成分	配制不同体积Urea-PAGE凝胶所需各组分的体积或质量
  10% Urea-PAGE	10mL	20mL	40mL
  30% Acr-Bis (29:1)	3.33mL	6.67mL	13.33mL
  TBE (5X,RNase free)	2mL	4mL	8mL
  尿素	4.2g	8.4g	16.8g
  DEPC水	定容至10mL	定容至20mL	定容至40mL
  10%凝胶聚合催化剂	0.05mL	0.1mL	0.2mL
  TEMED	0.005mL	0.01mL	0.02mL
  成分	配制不同体积Urea-PAGE凝胶所需各组分的体积或质量
  12.5% Urea-PAGE	10mL	20mL	40mL
  30% Acr-Bis (29:1)	4.2mL	8.4mL	16.8mL
  TBE (5X,RNase free)	2mL	4mL	8mL
  尿素	4.2g	8.4g	16.8g
  DEPC水	定容至10mL	定容至20mL	定容至40mL
  10%凝胶聚合催化剂	0.05mL	0.1mL	0.2mL
  TEMED	0.005mL	0.01mL	0.02mL
  成分	配制不同体积Urea-PAGE凝胶所需各组分的体积或质量
  15% Urea-PAGE	10mL	20mL	40mL
  30% Acr-Bis (29:1)	5mL	10mL	20mL
  TBE (5X,RNase free)	2mL	4mL	8mL
  尿素	4.2g	8.4g	16.8g
  DEPC水	定容至10mL	定容至20mL	定容至40mL
  10%凝胶聚合催化剂	0.05mL	0.1mL	0.2mL
  TEMED	0.005mL	0.01mL	0.02mL

  
  注1：将30% Acr-Bis (29:1)、TBE (5X)及尿素完全溶解后，或加入适量DEPC水完全溶解后，再用DEPC水定容。
  注2：由于尿素溶解时吸热，可在37℃适当加热以促进尿素溶解。
  注3：依次加入10%凝胶聚合催化剂和TEMED，混合均匀，灌胶，插入梳子，室温静置直至凝固(或放至37℃培养箱加热以加速凝固)。
  注4：如果配制非变性胶，参考上述配制方法，不添加尿素即可配制成非变性PAGE胶。
  
• 电泳：
  
  • 样品准备：根据RNA样品类型，选择适当的Loading Buffer。如果样品是ssRNA，将适量ssRNA样品与2X RNA Loading Buffer (货号：YTB0215)等体积混合，70℃孵育5～10min或95℃孵育1min，立即放至冰水浴中，该样品即可进行Urea-PAGE凝胶电泳；如果样品是dsRNA，将适量dsRNA与2X RNA Loading Buffer (货号：YTB0215)等体积混合，即可进行非变性PAGE电泳。
    
  • 电泳缓冲液准备：将TBE(5X)电泳缓冲液用DEPC水稀释至1X，例如200mL TBE (5X)电泳缓冲液中加入800mL DEPC水混匀后即为1X TBE电泳缓冲液，随后可直接将其加入至电泳槽中。
    
  • 上样：上样前先用1X TBE电泳缓冲液将每个上样孔中的尿素冲洗干净。上样孔中残留的尿素会影响核酸样品的沉降及后续的电泳。冲洗后即可按照实验目的适当上样RNA样品。
    
  • 电泳：当检测对象是ssRNA时，建议使用180V恒压电泳；当检测对象是dsRNA时，建议使用120V恒压电泳，电泳时间可根据核酸分子量大小自行决定。
    
  • 染色：电泳结束后，将凝胶取出放至洁净容器内(例如适当大小的玻璃培养皿)，用DEPC水清洗1～2分钟，然后加入约30mL核酸染色液，室温摇床染色15min，25rpm，最后用DEPC水洗涤2～3次，每次2～5分钟，即可使用凝胶成像设备观察电泳后的染色结果。推荐使用百奥莱博NadRed (EB升级换代产品，2000X，货号：YT015)进行RNA凝胶的染色，稀释时须使用DEPC水。